檢測原理

試劑盒采用雙抗原一-步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 。往預先包被病毒性腹瀉病毒抗ti的包被微孔中，依次加入標本、HRP標記的檢測抗原，經過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在suan的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在450NM波長下測定吸光度(OD值) ，與CUTOFF值相比較，從而判定標本中豬病毒性腹瀉病毒(BVDV) 的存在與否。

樣品收集、處理及保存方法

1.血清:使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.血漿: EDTA、檸檬suan鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。

3.細胞上清液: 3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉 離心10分鐘取上清。

5.保存:如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20°C， 避免反

復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.酶標儀(450NM)

2.高精度加樣器及槍頭: 0.5-10UL、 2-20UL、 20-200UL、 200-1000UL

3.37℃恒溫箱

操作注意事項

1.試劑盒保存在2-8°C，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現象，水浴加熱使結晶完quan溶解后再使用。

2.實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封(低溫干燥)保存。

3.預處理后的樣本請按照操作步驟用樣ben稀釋ye適當稀釋以達到試劑盒的的最jia檢測效果。.

4.嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.所有液體組分使用前充分搖勻。

大鼠P選擇素(P-Selectin/CD62P)ELISA試劑盒

常用方法：

1. 夾心法：

夾心法常用于檢測大分子抗原，一般的操作步驟為:

a. 將具有專一性的抗ti固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗ti進行專一性鍵結

c. 洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專一的一次抗ti，與待測抗原進行鍵結

d. 洗去多余未鍵結一次抗ti，加入帶有酶的二次抗ti，與一次抗ti鍵結

e. 洗去多余未鍵結二次抗ti，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果

原理：針對抗原分子上2個不同抗原決定簇的單克隆抗ti分別作為固相抗ti和酶標抗ti，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物。

2. 間接法

間接法常用于檢測抗ti，一般的操作步驟為：

a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余的抗原。

b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的一次抗ti，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結。

c. 洗去多余待測檢體，加入帶有酶的二次抗ti，與待測的一次抗ti鍵結。

d. 洗去多余未鍵結二次抗ti，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評估有色終產物的含量即可測量待測抗ti的含量。

原理：利用酶標記的抗抗ti以檢測已與固相結合的受檢抗ti。

3. 競爭法

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用于檢測小分子抗原，其操作步驟為：

a. 將具有專一性的抗ti固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗ti進行專一性鍵結

c. 加入帶有酶的抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗ti進行專一性鍵結，由于塑膠孔盤上固著的抗ti數量有限，因此當檢體中抗原的量越多，則帶有酶的抗原可鍵結的固著抗ti就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗ti鍵結，即所謂競爭法之由來。

d. 洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，當檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤內留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺。

e. 當需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗ti的抗原，或是不易得到足夠的純化抗ti以固著于孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。

試劑盒小貼士

1. 在收到試劑盒后，為保證檢測效果，需要根據說明書中保存條件正確儲存。除非特別注明，試劑盒大多是在2～8°C條件下儲存

2. 在實驗進行前，請確認包裝中的試劑盒成分與說明書一致，再進行后續操作

3. 溶解標準品過程中，注意標準品是否受潮，過程中要避免產生泡沫

4. 為了避免交叉污染，配置不同濃度標準品、上樣、加不同試劑都需要換槍頭。另外不同試劑請分別使用不同的移液槽

5. 每次孵育時，正確使用封板膠紙可保證結果的準確性

6. 正確洗板有助于實驗結果的穩定性

7. TMB顯色底物在上板前應為無色，請避光保存。加入孔板后，將由無色變成不同程度的藍色

8. 終止液上板順序需與底物上板順序一致，加入終止液，溶液顏色由藍色變為黃色。如果出現綠色，即表明終止液與底物未混勻，請充分混合

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